ImmunecontrolofPRRS:lessonstobelearnedandpossiblewaysforward

猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）是一种难以捉摸的宿主/病毒关系模型，其疾病由病毒的致病性、猪的品种易感性和表型、微生物感染压力和环境条件决定。这种疾病可以通过农场管理方案来控制，可以通过接种疫苗或驯化猪只适应传播的PRRS病毒来支持这些方案。然而，PRRS仍然是全世界养猪业遭受重大损失的一个原因。免疫控制策略往往因接种疫苗和受感染动物的适应性免疫发育不良和较晚而复杂化。此外，有证据表明，田间试验的结果可能比隔离设施中的实验研究结果更差。中和抗体（NA）可预防PRRSV感染。相反，在PRRSV感染后，NA和适应性免疫在病毒清除中的作用仍然存在争议。猪最终消除了PRRSV感染，这可能与一种“获得性的”先天免疫反应有关，这种反应也可能在接种疫苗后产生。除了接种疫苗之外，在“问题”猪场中，迫切需要对疾病流行和疾病相关损失进行实质性控制，可以合理地提倡PRRS的免疫调节策略。这与疫苗接种并不矛盾，疫苗接种最好只限于受PRRSV感染的农场中的PRRSV阴性动物。口服低剂量的干扰素-α治疗，在农场被证明对控制呼吸道和生殖疾病暴发有效，而隔离设施中的实验结果不太确切。考虑到PRRSV与细菌脂多糖之间的相互作用对呼吸系统疾病的发生至关重要，低剂量I型干扰素对体内外观察到的炎症反应的强烈抑制作用可能是在临床试验中观察到的快速临床反应的基础。

关键词：猪，PRRSV，疫苗接种，免疫调节，α-干扰素

导言

针对病毒性疾病的疫苗接种策略要取得成功，有两个基本原则。一方面，必须认识到病毒病原与传染病或传染综合征之间的因果关系，尽可能符合科赫法则。另一方面，在确定了病原体之后，在活的宿主中接种针对病毒的结构和/或非结构蛋白（NSPs）的疫苗后必须产生保护性免疫应答，以防止感染和/或疾病的发生。根据观察到的参数（感染程度和/或疾病症状），防护可定义为病毒学、临床或两者兼而有之。在这个概念框架中，已经为兽医领域的大量病毒类病原开发了有效的疫苗，例如牛瘟的根除（1）。除了这些成功的疫苗之外，还经历了重大的失败；其中，非洲猪瘟（2）的例子可能突出强调了疾病病原的重要性和应用研究努力程度的重要性。猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）在疫苗史上可能处于两个极端之间，在这两个极端之间，不断有PRRS疫苗效力的相互矛盾的报道，为了获得更有效的免疫产品，需要评估各种选择。事后看来，尽管在世界范围内进行了长期和详尽的研究，但上述两项疫苗要求并没有得到科学界对PRRS病毒（PRRSV）的一致确认或否定（3）。因此，在年欧洲首次分离出PRRSV后，在尊重科赫法则的基础上（4），实验性感染仅在妊娠晚期母猪中展现了与田间自然感染相一致的易感性。此外，许多其他复制疾病症状的尝试都没有成功，在PRRS模型中，宿主/病毒关系的基本问题仍然存在许多不确定的因素（5）。

疾病

猪繁殖与呼吸综合征出现于80年代末的美国，后来又在欧洲迅速传播，并在世界大多数国家的猪群中流行。经胎盘传播病毒的母猪的晚期生殖障碍、仔猪断奶前死亡率增高、断奶猪和育肥猪的呼吸窘迫、厌食和可能的皮肤充血是PRRS最明显的临床症状（6）。PRRSV是目前最重要的猪病原体之一，给世界各地养猪场造成重大经济损失。据估计，在美国，每年损失高达5.6亿美元。在其他生猪养殖活动密集的国家也可以预见到类似的影响。这种影响既与疾病发生（直接损失）有关，也与继发感染和/或生长抑制的发病率增加有关。病原体是动脉炎病毒科（Arteriviridae）的一种有包膜的正链RNA病毒（8）。尽管大多数猪场都存在PRRSV感染，但PRRS和PRRS相关疾病的患病率差异很大。迄今为止，已确定两种类型的猪动脉炎病毒病原：欧洲（EU）I型，第一株于年分离，命名为“Lelystad”；北美II型，于年分离，缩写为ATCCVR-（8）。在欧盟和北美类型之间只有50-60%的序列同源性（9），这意味着存在两种不同的基因型，它们来自一个共同的祖先（10）。总的来说，Ⅰ型和Ⅱ型PRRSV的病毒感染和疾病表现可能不同，后者更常与疾病症状相关。因此，与Ⅰ型PRRSV相比，Ⅱ型PRRSV优先建立感染和保护模型。特别是，I型PRRSV主要是一种与生殖相关的病原，而其在田间条件下对呼吸道疾病的直接作用尚不明确（11）。相反，两种PRRSV基因型对公猪生殖系统的毒力没有显著差异（12）。传统上疾病控制是建立在管理和生物安全措施相结合的基础上，通常以“稳定”猪群为优先目标，即繁殖猪群中没有PRRS的临床症状，并且PRRSV不再从母猪传染给后代（13）。在达到这种初步状态后，可以通过封群（14）来消灭病原，通过适当的空气过滤装置来防止空气传播感染（15）。除了管理和生物安全措施外，各种免疫学方法（接种疫苗和/或“驯化”循环中的PRRSV毒株）也用于控制呼吸和生殖疾病（6）。

疾病发生的危险因素

尽管在PRRS发病历史的一开始就认为其适用科赫法则，但大多数实验性感染研究未能引起明显的疾病（16），而且病毒常常在临床健康的猪中发现。此外，临床研究的结果将PRRS定义为一种多因子疾病，其中PRRSV毒株在与微生物和非微生物环境参数的相互作用下表现出不同的致病性特征，这在隔离设施的实验条件下很难重现（11）。应详细检查疾病发生的微生物和非微生物成分的继发感染。首先，据养猪业者报告，有广泛的间接证据表明，呼吸道疾病的流行往往与卫生和福利条件有关；调整基本的房舍条件，例如动物在断奶舍中的集中程度，可以深刻地影响呼吸道疾病的发病率和相关损失。其次，目前的瘦肉型猪表型以及PRRSV和细菌脂多糖（LPS）之间的协同作用可能加剧了集约化猪场的疾病发生；这是呼吸系统疾病发生的基础，而不是单独的PRRSV或LPS（17）。其机制可能与PRRSV通过小包膜蛋白E激活LPS诱导的巨噬细胞中的炎性介质有关，从而导致IL-1β释放增加（18）。瘦肉型猪的后果可能更糟，其特点是形成高水平的氧化应激（19）。这肯定会加剧PRRSV和LPS之间的重要协同作用，因为众所周知，活性氧代谢物会激活核因子κb（NF-κB）的炎症自动扩增过程（20）。因此，在集约化养殖场中，瘦肉型猪大量接触空气传播的LPS（21）进一步增加了这种风险。有趣的是，有证据表明，PRRSV在东欧传播了很长一段时间，之后才被确认为临床上明显的PRRS（22），这似乎暂时与80年代西欧出现瘦肉型猪以及年德国统一后它们与病毒的接触有关。非瘦肉型猪对PRRSV的易感性降低（23），德国本地品种的PRRSV感染与商品皮特兰猪的PRRSV感染的比较评估也表明了这一点（24）。后一个特征与越来越多的证据表明PRRSV易感性与猪的遗传组分有关（25）。在体外，早期诱导的I型干扰素（IFN）反应可能是长白猪巨噬细胞对PRRSV复制敏感性降低的基础（26）。

最后，猪的年龄起着重要作用，非成年动物对感染和疾病的易感性最大（27）。妊娠母猪在妊娠后期（在实验条件下妊娠72-93天），胎盘中积聚高度敏感的巨噬细胞后，始终易受生殖感染（28）。由于上述原因，同龄猪的疾病发生可能是三种不同因素的产物（图1）：

1.病毒致病性（至今定义不清）。

2.猪品种（易感性：汉普夏大白杜洛克长白猪）和表型（瘦非瘦）（25）。

3.环境条件。

上述三种因素中的任何一种都可能显著影响疾病在农场的发生和/或流行。因此，PRRS的致病性范围可能从亚临床到致命，发病率和死亡率以及直接和间接经济损失都有很大的波动（6）。这种疾病偶尔也会表现出极端的毒力，例如中国高热病毒、流产“风暴”病毒和一些白俄罗斯PRRSV株（29-31）的爆发。然而，即使对于这些毒株，PRRSV和细菌LPS之间的协同作用也可能在放大受感染巨噬细胞的炎症反应中发挥关键作用（32）。

PRRS病毒的生物学特性

猪繁殖与呼吸综合征病毒的核苷酸序列表现出极大的变异性，这可能意味着氨基酸的变化对诊断具有重要意义（33）。

有强有力的证据表明，PRRSV抑制了受感染巨噬细胞的T细胞识别（34），这可以通过猪肺泡巨噬细胞（PAM）的不良辅助特征得到缓解（35）。在PRRSV感染的猪中经常观察到明显的免疫抑制迹象，这有助于增加继发性细菌感染的发生率和严重程度（36），并导致“猪呼吸道疾病综合征”（PRDC）。

对于大多数PRSSV毒株，有证据表明，与猪的其他病毒感染相比，PRRSV感染早期的固有免疫系统反应不足，中和抗体（NA）和病毒特异性IFN-γ反应出现较晚、不稳定（37）。根据作者的经验，在实验条件下观察到的上述延迟可能很好地对应于在野外条件下长期缺乏病毒特异性IFN-γ应答（38），这与在感染II型PRRSV株的非成年猪中获得的结果一致（27）。而在PRRSV感染期间也可观察到早期的非特异性IFN-γ反应（39，40）。

人们对PRRSV的主要免疫抑制特性进行了积极的研究，以确定具有这种活性的结构和非结构病毒成分。至于I型干扰素应答的下调，PRRSVNSPs1α、1β、2、4和11起主要作用，其效应机制与干扰素应答因子（IRF）3、干扰素刺激基因因子3（ISGF3）和信号转导和转录激活因子（STAT）1的失活和阻断核易位，以及ISG15（一种由ISG15基因编码的泛素样蛋白）和IκB激酶（IKK）α（分别为IFN反应和NF-kB信号传导）的处理有关（41）。在实践中，有证据表明NSPs发挥了多种抑制功能，而进一步的抑制活性可能与通过核衣壳蛋白（N）产生IL-10有关（41）。这些抑制性特征可能被与免疫系统调节通路冗余相关的代偿机制抵消。特别是，如前一篇综述（42）所强调的，IL-10和IFN-β的最终水平将取决于PRRSV感染和LPS驱动的toll样受体4（TLR4）激活；此外，最终NF-kB信号水平将由N蛋白的正调控作用和NSP的负调控作用决定。

免疫抑制也可以由T调节（Treg）细胞来解释，这些细胞是在感染II型PRRSV株后产生的（43）。

总的来说，任何PRRSV毒株的免疫抑制作用都可以根据IFN和IL-10在体内和体外的反应进行方便的评估。在这方面，在PRRSV感染期间的细胞因子反应谱和在这些谱下存在的PRRSV的完全“免疫型”被暗示为可能的致病因素。特别是，PRRSV在感染猪体内诱导和扩增IL-10应答的特性以及与其他微生物制剂的可能协同作用已在体外和体内得到证实（45）。血清IFN-γ浓度降低和IL-10反应的持续可能导致巨噬细胞中CD的上调（46），这可能有助于增强PRRSV的复制和病毒血症的长期持续。

多数I型PRRSV毒株的上述特征不同于欧盟3型毒株和中国II型毒株，后者在感染后早期诱导IFN-α和炎性细胞因子应答，随后持续IL-10应答，通常与PRRSV感染的严重临床转归有关（47，48）。这些特征（IFN-α和IL-10反应）与中等毒力I型PRRSV株的特性一致，而在相同的实验条件下，感染减毒PRRSV株后，早诱导期的IFN-γ反应，病毒血症很快停止（40）。此外，在妊娠第85天（49天）感染PRRSV的母猪出现早期IFN-α反应。在猪浆细胞样树突状细胞培养物中，某些PRRSV株可以在体外复制这种反应（50）。最重要的是，伴随的IL-10和IFN反应可导致促炎活性增加，如人类内毒素血症模型所示（51）。因此，推测PRRSV感染动物IL-10反应的程度和时间对炎症反应和相关的临床反应都是至关重要的。

总的来说，PRRSV株引起不同的细胞因子反应，在上述极端病毒表型之间波动（图2）：

弱毒：如果观察到任何早期的，可能是非病毒特异性IFN-γ反应则病毒血症较为短暂。

抑制性：这些毒株诱导先天免疫和适应性免疫的延迟和不稳定发展，通常与未成年纯种PRRS阴性猪感染后的长期病毒血症相关。

炎症性：早期，观察到强烈的炎症细胞因子反应和持续的IL-10血浆水平，这通常与严重的临床症状相关。这种病毒表型可能在纯种PRRS阴性猪的生殖和呼吸道感染后满足科赫法则。

反过来，这三种病毒表型在概念上与上述病毒“免疫型”在体外显示一致（44）。

免疫保护和病毒清除机制

尽管猪动脉炎病毒和PRRS之间的因果关系可以在许多II型毒株中得到证实，但绝大多数I型（EU）毒株并非如此，在实验条件下通常会引起亚临床感染和相对较低水平的病毒血症（3）。此外，欧盟和北美毒株在受控条件下的试验和农场田间观察结果之间也存在重大差异（52）。这突出了该病的复杂发病机制，这是有大量现场试验和实验室感染方案相互矛盾的报告和数据的基础。

最重要的是，明确的免疫保护相关因素的定义仍然存在争议。ELISA观察到的抗体反应不是保护性的，这些免疫球蛋白的一部分与PRRSV感染的免疫增强作用有关（53）。通过连接肺巨噬细胞中的猪FC-γ受体I抑制抗病毒细胞因子反应可能是观察到的不良反应的原因（54），这也可能与抗独特型抗体反应有关（55）。关于PRRSV的黏膜抗体反应的报道很少，这在科学界被忽视了。根据作者的经验，在原发性感染期间，唾液中对PRRSV的IgA抗体反应与血清抗体反应同时发生，即使持续时间较短，随后出现抗体产生的“波动”（Amadori，Razzuoli，未发表的数据）。

细胞毒性T淋巴细胞不能清除受PRRSV感染的巨噬细胞（56），补体和吞噬细胞的抗体依赖性裂解也不起作用，因为病毒糖蛋白不在质膜上表达（57）。因此，在PRRS阴性猪的原发性感染中，病毒血症的衰退并不依赖于对PRRSV的适应性免疫反应（37）。特别是，病毒血症的水平和持续时间在激发后的前3周不受PRRSV特异性IFN-γ反应的影响（58）。病毒血症的消退可能与激活的自然杀伤（NK）细胞早期非病毒特异性产生IFN-γ有关（39）。相反，在后期（感染后第三周），血清IFN-γ浓度显示与血清病毒RNA载量和临床症状严重程度相关（59）。NA和PRRSV特异性IFN-γ应答在疫苗接种或原发性感染后的保护作用得到了强调（60，61）。特别是，通过被动转移NA到成年猪和非成年猪身上证明了其保护作用（62，63）。在马和小鼠的动脉炎病毒感染中也观察到了类似的结果（61）。关于PRRSV感染后病毒清除率的研究结果不太清楚，而且肯定存在争议。因此，最近的一项实验研究（64）表明，病毒血症可能与NA共存数周，在某些情况下，异源中和可能比同源中和更有效。此外，一种商业灭活疫苗被证明能引起强烈的感染后记忆NA反应，且无保护作用（65）。总的来说，血清NA和PRRSV特异性IFN-γ分泌细胞（SC）的水平不能完全描述为与保护性免疫相关的免疫效应器功能水平（3），这可能是相互矛盾的报道不断出现的基础。特别是，一些病毒株可能无法诱导令人满意的NA反应，而其他PRRSV株可以诱导交叉反应NA。这可能与“聚糖屏蔽”状态有关，即关键中和表位的糖基化（66）。总的来说，应该进一步研究体外中和作用，因为NA反应可能与保护有关（62），也可能与病毒血症长期共存（64）。这可能意味着体外测定的中和作用可能与体内有效的免疫效应器功能对应，也可能不对应。此外，在PRRSV感染或接种疫苗的动物中也不会出现典型的记忆抗体反应（3）。最后，有强有力的证据表明，体外测定的免疫活化（PRRSV特异性IFN-γSC的测定）水平与分别用于猪免疫和体外回归试验的PRRSV毒株的遗传差异无关（67）。

上述关于PRRSV感染的发现应该跟与其密切相关的乳酸脱氢酶升高病毒（LDV）的研究相抵消，LDV是一种小鼠嗜巨噬细胞的动脉炎病毒。在感染的急性期之后，在宿主的余生中，血液中的LDV水平仍然很高（68）。病毒血症维持在一个恒定的水平，在免疫耐受的小鼠和那些病毒特异性体液和细胞介导反应增加的小鼠中观察到相同的感染过程（69）。这意味着在小鼠模型中，适应性免疫在已建立的动脉炎病毒感染的控制中几乎不起作用。这一原理在感染强毒力的I型3亚型白俄罗斯PRRSV株后在PRRS模型中得到证实（图3）。与亚型1毒株（48）相比，这导致了更大的临床病症和肺部病理学变化，并表现增强的和更早的适应性免疫应答（IFN-γSC和抗体）。这种影响可以通过增强炎症反应来解释，而不是通过更高的病毒复制来解释（48）。用含有PRRSV开放阅读框（ORF）5、6和7的DNA疫苗对猪进行免疫，复制了相同的结果。与对照组、未接种疫苗的动物相比，DNA免疫的猪在感染病毒后出现了更强和更早的抗体反应，PRRSV特异性IFN-γSC升高，同时血清中IL-1β水平升高（70）。除适应性免疫外，PRRSV易感巨噬细胞在感染过程中（34、71、72）的缺失可能在病毒血症的消退和病毒感染的进一步控制中起重要作用。总的来说，上述发现意味着在（a）缺乏允许病毒复制的巨噬细胞和（b）由于有效的先天免疫应答而产生对病毒复制性感染不耐受的巨噬细胞之后，已建立的PRRSV感染可以得到有效控制。此外，有效控制炎症反应在预防PRRSV感染猪出现严重临床症状方面也起着至关重要的作用。

NK记忆细胞：缺失的环节？

对PRRSV的天然免疫反应表现为不同的形式。其中，最近关于PRRS模型中防御素和cathelicidin（组织蛋白酶抑制素，一种内源性抗菌多肽类物质）家族的某些肽的抗病毒活性的报道（42）值得高度

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