神经调质褪黑激素（melatonin）通过激活两种G蛋白偶联受体MT1和MT2来同步昼夜节律和相关生理功能。松果体在夜间按昼夜节律释放褪黑激素，激活下丘脑视交叉上核的褪黑激素受体，使动物的生理机能和行为与光-暗周期同步。MT1和MT2是明确的用于调整睡眠障碍和抑郁的昼夜节律周期的药物靶标。尽管它们很重要，但很少有体内活性的MT1选择性配体被报道，这阻碍了对昼夜节律生物学的理解和靶向治疗的发展。今天给大家介绍一下UCSF的BrianK.Shoichet、北卡罗莱纳大学教堂山分校的BryanL.Roth和纽约州立大学布法罗分校的MargaritaL.Dubocovich等人年发表在Nature的工作。此前，上述课题组已用类似的策略发现靶向AmpC和D4的新型小分子药物（点此链接查看原文）。在这篇工作中，研究人员将超过1.5亿个虚拟分子对接到MT1的晶体结构上，合成和测试了38个排名靠前的分子。随后，作者基于结构优化得到了两种选择性的MT1反向激动剂，并在小鼠模型中进行了验证。该研究表明可通过MT1选择性配体调节褪黑激素受体的生物学功能，以及从基于结构的超大分子库筛选中发现之前未报道过的全新分子。

——先导化合物筛选——

研究人员的思路是从对接筛选中优先考虑先前未报道过的配体，以期与MT1/MT2发生差异性相互作用。MT1和MT2正构位点高度的相似性（21个残基中的20个是相同的）给对接选择性带来很大的挑战。作者对接了超过1.5亿个来自ZINC库的“lead-like”分子，这些分子没有被合成过，但通常可以通过双组分反应得到。库里的每个分子通过DOCK3.7在MT1的正构口袋里平均采样超过万个poses（个取向*个构象），总共产生了超过72万亿个蛋白-pose复合物并评估了每个复合物对应的物理互补性打分。为了寻求多样性，作者通过拓扑相似性对打分排名前30万的分子进行聚类，共聚成类，且将与ChEMBL23中已知的MT1和MT2配体相似的聚类分子剔除（见图1a）。对前10,类中得分最高的分子与MT1晶体结构中与配体有相互作用的残基之间的相互作用进行了检查。在对接的复合体中，这些检查具体包括了配体与QECL2、N.60、TECL2和N.52形成的氢键，还有与A.56、G.29和FECL2的主链原子形成的氢键。构象扭曲和氢键供体不足的分子被剔除。在得分最高的类中，所有的分子都会被检查然后排序。最终，40个排名在16~的分子（即1.5亿多对接分子中排名前0.01%至前0.1%的分子）被选中进行从头合成和测试，其中38个分子被成功合成出来，15个分子对人的MT1和MT2受体有活性，命中率为39%。

这些活性分子包括激动剂和反向激动剂（如图1d），且与已知的褪黑激素受体配体的相似性较低。为了证明这些分子的新颖性，作者定量化比较了这些分子与已知配体的拓扑相似性，并将新配体与已知活性分子最接近的类似物分子进行了视觉上的比较。不同结构的分子往往与相同的残基相互作用。例如晶体结构中2-苯基褪黑素的甲氧基与N.60之间的氢键相互作用，在对接模型中，是由酯(ZINC)、吡啶(ZINC)和苯并二氮杂环(ZINC)与N.60形成氢键来实现的。类似地，2-苯基褪黑素与FECL2的吲哚发生堆积，而对接配体中参与作用的是苯并恶嗪(ZINC)，噻吩(ZINC)和呋喃(ZINC)。2-苯基褪黑素通过其乙酰胺与Q形成氢键，而对接的配体则使用酯或吡啶(图1d)。新的配体也会与新的残基发生作用，包括与TECL2,N.52,A.56,G.29和FECL2形成氢键（图1b/1c）。

图1.超大库对接发现新型、强效的褪黑激素受体配体。a，从1.5亿分子库中对接筛选全新的褪黑激素受体的配体。b，nM活性的MT1/MT2非选择性激动剂ZINC的对接位置。c,MT2的选择性反向激动剂ZINC的对接位置。d，对接活性排名前15的分子，蓝色和红色强调了与受体发生相互作用的基团，分别对应于褪黑激素的乙酰胺侧链和甲氧基吲哚官能团。方框分子是反向激动剂。

——发现有独特疗效的分子——

对接结果发现有4个配体是MT1选择性激动剂（对MT1的EC50在2~6μM范围内，在30μM以下均无法检测到MT2活性）：ZINC,ZINC,ZINC和ZINC。值得注意的是，ZINC虽然没有选择性，但它对MT1的活性达到1nM，是直接从对接筛选中发现的活性最好的分子之一。同样的，尽管作者只对接了MT1，但由于MT1和MT2的结合口袋太类似了，许多配体会对MT2有活性甚至选择性。因此，尽管最初与MT1结构对接发现了全新结构的有效分子，但它们也有可能对MT2有效。这既证明了化学新颖性作为分子排序的优缺点，也说明了进一步优化的必要性。

作者从15个对MT1和MT2有活性的分子中选出12个来优化。先从定制库中选择类似物，将数千个分子对接到MT1口袋。然后合成和测试了个类似物，其中94个分子在≤10μM浓度下对MT1或MT2有活性。在这12种化学型中，其中5个表现出比优化前更高的效力。

研究人员接着研究MT1/MT2选择性配体的体内表现，这些此前都尚未报道。作者主要对两种MT1选择性反向激动剂ZINC和ZINC（以下简称为UCSF，UCSF）的亲和力、体外信号传递、药代动力学、对小鼠以及人褪黑激素受体的选择性（图2），及其在小鼠昼夜节律行为中的功效（图3）等方面继续进行研究。

通过2-[I]iodomelatonin竞争实验，作者发现UCSF和UCSF对人源MT1（hMT1)受体有更高亲和力，与预期相符，其抑制常数分别为nM与nM，添加GTP后G蛋白解偶联，抑制常数分别提高到7.5nM和63nM，也再次证明了它们是反向激动剂（图2a，b）。接下来作者通过检测异丙肾上腺素（isoproterenol)刺激产生的cAMP分析UCSF和UCSF对hMT1和MT2的抑制作用，结果发现它们对hMT1的EC50分别为41nM和21nM，并且对hMT1的活性比hMT2分别强53和31倍（图2c，d）。而对于小鼠MT1（mMT1）和MT2（mMT2）受体，UCSF和UCSF表现出更好的MT1选择性（图2e，f）。因此，作者对两种选择性MT1反向激动剂进行体内小鼠实验。

图2.MT1选择性反向激动剂对人和小鼠MT1和MT2受体的亲和力和抑制效力。

作者首先检查了两种MT1选择性反向激动剂在生物周期形成实验小鼠模型中的体内活性。在实验中，小鼠的光暗周期被突然提前6h，并在新的黑暗开始时连续3天进行药物处理，以评估适应速率，用以模拟人类向东飞行的时差反应。实验发现褪黑素激动剂（30μg/只）可以加快小鼠的适应速率，这与它在治疗人类向东时差反应中的用途一致。相反，非选择性反向激动剂luzindole降低了适应速率（图3b）。MT1选择性反向激动剂UCSF和UCSF（30μg/只）也降低了小鼠的适应速度（图3a，b），并且与luzindole（μg/只）相比，剂量要低十倍。有趣的是MT1选择性反向激动剂表现出了比非选择性激动剂更好的作用，这暗示反向激动剂的节律调控作用可能是由MT1所介导的。因此作者在WT和MT-knockout(MTKO)的小鼠中进行实验，发现在MT1KO小鼠中UCSF的作用消失，但在MT2KO小鼠中作用没有消除（图3c），这说明其调节昼夜节律的活性是由MT1受体介导的。

接下来，作者通过监测小鼠的跑轮运动检测其对昼夜节律相位的影响，发现在黄昏（CT10）给药的小鼠，两个反向激动剂都表现出了相位前移的效果，与激动剂效果一致（图3d）。接下来作者分别在WT和MTKO的小鼠中进行了实验，发现在WT小鼠中昼夜节律提前了1.3-1.5小时，这种激动剂样作用在MT1KO小鼠中被消除，但在MT2KO的小鼠中保留，进一步验证了反向激动剂的节律调控作用是由MT1引起的（图3e）。综上，这项研究阐明了MT1选择性配体可以调节褪黑激素受体生物学功能。

图3.MT1-选择性反向激动剂加快了小鼠适应速率并使其昼夜节律相位前移。

——讨论与总结——

总的来说，研究人员通过对接1.5亿的超大虚拟分子库，发现了多个有全新骨架、全新信号传导机制和药理学机制的高活性MT配体分子。作者并没有采用基于结构的设计策略，而是

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